大家好，我是濤濤。上一篇我们一起学习了单基因的泛癌分析，你学会了吗？

（藏鏡人：啊这……别问，问就是没有）

（濤濤醬：那还不赶紧戳这个连结复习一下？

文章复现丨用了这个工具，带你快速复现一篇单基因泛癌免疫分析wen）

那么我们文章复现的第二期，就继续深入，一起来探讨一下单基因在具体肿瘤中的复现思路。

今天我们无代码复现一篇2021年3月发表在Agin-us的一篇4.831分的文章。

同样的道理，隆重推出我们的仙桃生信工具了！不用代码，不用R语言，只要鼠标！只要鼠标！单基因分析带回家！

我们今天的文章题目：A bioinformatic analysis: the overexpression and clinical significance of FCGBP in ovarian cancer

今天作者找到的基因是FCGBP，即Fc fragment of IgG-binding protein。在许多肿瘤中都有这个基因的差异化表达情况。作者在这篇文章中，通过探讨FCGBP在卵巢癌的免疫细胞浸润的作用，论证其在卵巢癌的临床意义。

在“材料和方法”部分，作者开宗明义地阐明了本文实现的生信手段。

眼尖的小伙伴一定发现了，这篇文章有用到了qPCR以及免疫组化的部分

没错，这就是传说中的“干湿结合”。生信+基础实验验证，就是应验了中国的古话，“男女搭配，干活不累”。这篇文章也因此发到了比较高分的期刊上。

那么接下来我们一起来看一下本次的复现任务。

图1. FCGBP在泛癌的表达分析

图2.FCGBP在卵巢癌组织中的表达情况

图3. Kaplan-Meier生存曲线比较了FCGBP在TCGA中的预后，以及两幅与FCGBP高表达或低表达的热图

图4. 与FCGBP相关的分子在卵巢癌的GO、KEGG、GSEA分析

图5. FCGBP在卵巢癌与与免疫浸润水平的相关性

图6. FCGBP表达与巨噬细胞浸润和极化相关性

图7. FCGBP表达与M2样巨噬细胞浸润和极化相关性

复现工具
◆ 仙桃学术工具
（https://www.xiantao.love/products）◆Kaplan-Meier Plotter网站（http://www.kmplot.com/analysis/）◆ TIMER数据库
（http://timer.cistrome.org/）◆ HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/）◆ GEO数据库
（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=）

现在一切准备就绪，没时间解释了，快上车！跟着我一起开始复现之旅吧！

Figure 1

FCGBP在泛癌的表达分析

Figure 1A

复现步骤：

进入仙桃学术工具（https://www.xiantao.love/products）；选择高级版，点击“立即使用”（注：免费版和基础版都可以进行统计和可视化，由于高级版功能最全，这里选择高级版作为范例）

选择表达差异（挑）- 非配对样本，点击进入。选择疾病-泛癌。因为有的癌种的正常样本数不够，用GTEx数据库的正常样本补足，将TCGA与GTEx数据库联合分析。这里建议选择XENA-TCGA-GTEx泛癌数据。参数部分的类型选择-箱图/柱状图，基因输入FCGBP。点击确认。

FUNDC1泛癌的结果就分析出来啦。保存结果，点击大图，下载pdf文档。

大家可能注意到，这个和原文的图有些许不同。

因为原文作者是用R语言作图的。

目前全网任何一个在线工具，包括我们熟知的Oncomine都无法做出那样“妖娆”姿势的图片。

不过濤濤想说的是，我们生信分析，最重要的就是能出重要结果就好啦。至于一个图“水桶腰”还是“A4腰”，有那么重要吗？

（藏鏡人：有！很重要！）

（濤濤醬：那你就自己一年半载地学R语言代码去吧。我用优秀的“仙桃工具”一年半载地无代码发10多篇出来甩你一百条街(￣O￣)ノ）

Fig1B-1D

这个图是单基因在GEO里面的表达分析实现的。

这个功能目前仙桃工具的程序员小哥哥正在努力地实现当中。

（濤濤醬：噓，悄悄告诉你，这篇推文发出去的时候，估计已经实现了喔）

其实我们自己也是可以做到的。

俗话说，做人嘛……

（藏鏡人：(抢话) 最重要的是开心！）

（濤濤醬：不对，做人嘛，不要那么懒）

那我们来看看如何自己借助GEO实现！

首先，搜寻GEO数据库

选择DataSets

或者直接进入GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）

在GEO DataSets的检索框中输入GSE12470

往下卷动鼠标，在新页面中下载表达矩阵文件。

用EXCEL文件打开矩阵

第一列为探针名，我们需要根据探针，找到FCGBP基因

本套数据使用GPL887芯片，因此，下载GPL887芯片信息

点击Download即可进行下载。

依然是使用EXCEL打开文件。

使用查找功能，找到FCGBP对应的探针：8557

打开GSE12470矩阵，找到8557对应的表达值

找到不同组别的信息

整理矩阵信息

根据实验描述内容，将53例样本，分成I-43例，II-10例

选择仙桃工具—基础绘图—配对图—分组比较，选择点图，点击上传

即可出图

此处我们举一反三

转换另一种思维模式，如果是在TCGA中的卵巢癌中，想看看表达情况是如何，该怎么做呢？

选择表达差异（挑）- 配对样本，点击进入。选择疾病-卵巢癌。参数部分的类型选择-点图，基因输入FCGBP。点击确认。

最后把以上几个获得的分析结果在Illustrator或者Photoshop软件中进行拼图，就得到我们的图1。

或者采用我们仙桃最炙手可热的拼图功能喔！（这回程序员小哥哥又开发了一大利好，那就是可以用自己的图片来拼图啦！）

选择基础绘图 –上传图片，点击进入

此处开始上传自己的图片，但是记得图片要为pdf、tiff、tif、png的格式喔！

上传好之后，可以调整图片的宽度和高度参数，最后点击确认。

记得点击下方第一个“保存结果”按钮，才能进行下一步的拼图喔！

点击拼图工具，进入拼图页面。

拖拽目标图片进入画布。（在对齐图片的时候可以选择横向参考线和纵向参考线辅助对齐。两个图片对齐时，接近辅助线的时候还有磁吸功能，拼图非常便利！

点击PDF下载，还会自动标记字母哦！点击下载，即可保存成pdf图片。（小贴士，这里也可以把图稍微放大，或者两图直接的行间距放大，可以在右侧减少留白）

这样图就拼好啦！是不是比其他软件更轻松更便利呢？（是！）

Figure 2

FCGBP在卵巢癌组织中的表达情况

这个部分呢，作者是自己做免疫组化的照片。

在这里，濤濤教大家如何用数据库里现有的照片复刻这样“壮观”的景象。

那就隆重推出我们的HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/）

Human Protein Atlas 数据库，简称HPA数据库，它致力于提供全部24,000种人类蛋白质的组织和细胞分布信息，并免费提供公众查询。

创立这个数据库的瑞典 Knut & Alice Wallenberg基金会使用特制的抗体，用免疫组化的技术，检查每一种蛋白质在48种人类正常组织，20种肿瘤组织，47个细胞系和12种血液细胞内的分布和表达，其结果用至少576张免疫组化染色图表示，并经专业人员阅读和标引。这些受检组织来自144个不同个体和216个肿瘤组织，保证染色结果具有充分的代表性。这是一个大规模蛋白质研究项目，主要目的是绘制人体组织和细胞中表达基因编码的蛋白位置。

那么该如何使用呢？

登入网址。

在搜索框搜寻“FCGBP”

结果可以看到正常组织、病理状态下等等不同的样式。

我们选取“TISSUE”这个界面

就会看到

由于我们要研究的是卵巢癌，所以我们选中FEMALE TISSUES

进一步地

这里面就有我们类似文章中的图啦。

（藏鏡人：哇，原来HPA数据库那么好，可以“以假乱真”，就好像自己真的做了免疫组化实验一样欸！）

（濤濤醬：对啊，你还不会用HPA数据库吗？那就赶紧看看我们的单元课吧！）

Figure 3

Kaplan-Meier生存曲线比较了FCGBP在TCGA中的预后，以及两幅与FCGBP高表达或低表达的热图

我们先看生存曲线图

这边是FCGBP在不同肿瘤中的预后OS

我们有两种方法实现。

法一（Kaplan-Meier Plotter）：

复现步骤：

打开Kaplan-Meier Plotter网站（http://www.kmplot.com/analysis/）

跟着我，点击如下按钮。

这里可以选择21种肿瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌）超过54000个基因（mRNA, miRNA, 蛋白）进行生存分析。其数据主要来源于GEO、EGA和TCGA。只有你想不到，没有你没想到！

紧接着，在方框里输入我们要复现的FCGBP，选择分析的结局指标OS，而后勾选不同的癌种，最后点击下图的分析按钮。

就可以实现生存曲线的绘制！

同样道理，勾选别的癌种，就可以出来不同FCGBP在不同肿瘤的情况。

保存即可下载至电脑中。

第一种方法学会了吧？

第二种方法就是我们厉害的仙桃学术！

法二：仙桃学术

复现步骤：

选择临床意义（靠）- KM曲线图，点击进入

选择TCGA-OV, FPKM, 分子输入FCGBP，预后类型选择OS，点击确认。得到以下的结果。保存结果。

再来是我们图3的另外两幅图。

这两幅热图都是我们TCGA里面有关FCGBP的前50个基因的热图呈现喔！

那如何呈现呢？

我们一起来看看！

主要的思路是这样的：

第一步，先在TCGA中进行单基因相关性筛选

第二步，选出前50个基因

第三部，画热图。

复现步骤：

选择交互网络——分子相关性分析——单基因共相关性筛选

输入卵巢癌TCGA-OV，选择FPKM，输入分子，点击确认如下

这边会提示结果正在运行中

大家别急，这一步可不是你想的一秒能出结果喔！

因为这一步涉及了后台大量的运算。

何不喝口水，休憩一下呢？

当你喝完水之后，点击“历史记录”

如果显示“正在运行中”

那就请大家再多喝一口水。

（藏鏡人：大概要多久呢？）

（濤濤醬：齁！你很猴急欸！大概1分钟就好啦。但是需要你手动F5重新整理刷新页面喔）

当运行好了之后

会提示“已完成”

这样我们下载我们需要的数据。

下载的格式有很多种，此处选择“Excel”形式来演示。

打开Excel表格

接下来我们需要手动筛选出关联前50的基因。

（濤濤醬：这步很快，跟着我，一分钟选好！）

作者首先是要选择正相关的前50。

于是我们瞄准cor_spearman这一列

然后进行筛选，选择“降序”排列，即图中所示“从最大到最小排序”

然后我们手动选择前50个

将50个基因复制

选择分子相关性分析——单基因共表达热图

选择卵巢癌，在“分子”那一栏输入FCGBP

在“分子列表”里贴上刚刚复制的50个基因

点击“确认”

是不是发现基因名都挤在一起了？

别慌，调整图片高度大小。

再次“确认”——查看大图

结果就出来啦！

同理，如果要选择负相关的话，在筛选那列反向筛选即可！

其他几幅图同理可得。最后把这些图放在Illustrator或者Photoshop软件采用我们仙桃最炙手可热刚刚“出炉”的拼图功能喔！

（藏鏡人：啊……拍谢！我刚看就忘了怎么拼图……）

（濤濤醬：那就请往上滑再复习一下吧！）

Figure 4

与FCGBP相关的分子在卵巢癌的GO、KEGG分析

前三图分别是GO分析里的BP、MF、CC内容

我们以BP为例

这里是与FCGBP正相关前300个分子

于是我们将图4的相关性列表里，同样道理排序、筛选出前300个分子，然后复制到新的Excel文档中。

而后打开功能聚类（圈）——GO|KEGG富集分析

在框中上传数据

而后在富集分析的条目中，选择GO:BP，点击确认

这里可以保存下载结果。但是如果要出图的话，这里一定记得要点击“保存结果”喔。

而后选择GO|KEGG——GO|KEGG可视化

选中刚刚保存的数据，类型选择柱状图，点击确认

结果出来了

同样的道理，在条目里可以选择进行MF、CC的分析。

而这个图，则是之前在富集的时候，在条目里选择KEGG

而后“保存结果”，在“可视化”里选择“气泡图”

最后将这些图拼起来就好啦！

（濤濤醬：提问一下，该怎么拼？）

（藏鏡人：Emm，不好意思，我又忘了）

（濤濤醬：好吧，那我再说一遍，记住啦！）

在Illustrator或者Photoshop软件中进行拼图或者采用我们仙桃最炙手可热的拼图功能喔。

选择基础绘图 –上传图片，点击进入

此处开始上传自己的图片，但是记得图片要为pdf、tiff、tif、png的格式喔！

上传好之后，可以调整图片的宽度和高度参数，最后点击确认。

记得点击下方第一个“保存结果”按钮，才能进行下一步的拼图喔！

点击拼图工具，进入拼图页面。

这样图就拼好啦！记住了吗？

（藏鏡人：这回真的记住了！）

Figure 5

FCGBP在卵巢癌与与免疫浸润水平的相关

首先复现A图

交互网络（联）——免疫浸润——分组比较图

选择“卵巢癌”—FPKM，选择基因FCGBP，在“算法参数”里面选择图中的 Activated Dentritic Cells 即adc

在“算法参数”里面选择不同的细胞，就可以分析出不同的图。

图B是免疫检查点的作图。这个功能仙桃程序员小哥哥正在抓紧实现中。

听说不久的将来也能实现喔！

（藏鏡人：那有没有类似的图呢？）

（濤濤醬：当然有啊，而且个人感觉比这个图更好看呢）

与之类似的有免疫浸润点的棒棒糖图。我们一起来看看吧！

选择交互网络（联）——免疫浸润——棒棒糖图

选择好对应的肿瘤以及基因FCGBP

点击“确认”

调整好图片的宽度，因为有可能x轴文字太多会堆在一起

查看大图

是不是也是相当的美观呢？有种童年时候遇见一排棒棒糖的兴奋感对吧？

（藏鏡人：真的很有视觉冲击欸！）

Figure 6

FCGBP表达与巨噬细胞浸润和极化相关性

这个图是FCGBP与免疫细胞浸润的相关性

有没有觉得很眼熟？

（藏鏡人：有！上一期有讲过！）

就和我们上一期复现的图是一个道理啦

提到免疫浸润，大家应该脑中应该想到两个方法：Timer 和仙桃！

我们分别来看看两个方法

法一：TIMER

登录TIMER数据库(http://timer.cistrome.org/)的网站

选择Immune Association里面的Gene

而后，在方框里选择基因FCGBP以及需要探究的免疫细胞。

点击“submit”

在方框里搜索 ov （代表卵巢癌）

点击与本文相符的第一个方框

出来如下的界面

右图就是我们复现的图啦

同样道理可以点击其他的方框出现其他结果。

法二：仙桃学术

选择交互网络（联）–免疫浸润—散点图，点击进入

选择疾病TCGA-OV，FPKM，选择分子基因FCGBP

再选择浸润的细胞“Macrophages”

点击“确定”

即可出图

同理可绘制出其他图

最后把它拼图起来就可以了！

（濤濤醬：如何拼图？）

（藏鏡人：我知道！）

在Illustrator或者Photoshop软件中进行拼图或者采用我们仙桃最炙手可热的拼图功能！

Figure 7

FCGBP表达与M2样巨噬细胞浸润和极化相关性

来到我们最后一个图啦！
图7是由三组类似的图组成，于是我们只看最后两个图，图E和图F。

图E是FCGBP与TGFB1在泛癌的表达关系

图F是FCGBP与TGFB1在卵巢癌的关系

图E

登录TIMER数据库(http://timer.cistrome.org/)的网站

选择Cancer Exploration里面的Gene_Corr

在框中分别输入两者基因

点击“submit”

出来了泛癌里面两者的相关系数

下载表格

选中这栏即为“系数”

而后新建一栏，定义为“-log10P”

选择—log以10为底P值的对数

填充即可获得此列

提取出这两列，复制到新的Excel里

接下来，打开“仙桃学术” 基础绘图——散点图

上传数据

点击“确认”

就可以得出两者关系在泛癌的散点图

图F

两种方法

法一：timer

与图E的前半步骤相同

抵达这步时

点击OV 即可出现图片

法二：仙桃学术

选择交互网络（联）——分子相关性——散点图

填好疾病，两个分子，点击“确认”

即可出图

另外两幅图同理可得

最后再将其拼图起来就可以啦！

（濤濤醬：需要我再说如何拼图吗？）

（藏鏡人：需要的话请自行往前滑看前文回顾喔）

本期是我们的单基因在具体肿瘤的研究，其中也包含了有关泛癌研究的相关内容。

（藏鏡人：我感觉看了这两期单基因研究复现之后，感觉分分钟发文好几篇，都不想学R语言了欸！）

（濤濤醬：哈哈，那就快点登陆仙桃www.xiantao.love开始实操吧！）

卵巢癌单基因怎么发？看这篇一起零代码复现就对了！

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figure 5

Figure 6

Figure 7

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