增强子的重编程促进胰腺癌的转移

摘要

胰腺导管腺癌（PDA）是最致命的人类恶性肿瘤之一，部分原因是其转移倾向。本文研究在小鼠类器官PDA模型中研究转录和增强子在疾病过程中如何改变。研究表明转移性的改变伴随着增强子活性的大量复发性的改变。研究中将FOXA1作为系统中增强子激活的驱动因素，这种机制使得PDA细胞在试管内生长更具侵入性和更少的锚着依赖性，以及在体外更多的转移。在这种情况下，依赖FOXA1的增强子能够重组激活胚胎前肠内胚层的一个转录程序。总而言之，研究涉及增强子重编程，FOXA1上调和PDA转移的逆行发育转变。

1 PDA类器官的表观基因组分析识别和转移相关的增强活性的反复改变

本研究使用了2个正常（N），2个上皮内瘤变（P）和6对原始肿瘤（T）及其对应的转移（M）的类器官ChIP-seq数据，对H3K27ac富集的区域进行比较，识别出其他组织H3K27ac峰值比正常组织高出10倍的区域作为GAIN regions。

从下图中可以发现GAIN regions中表观遗传的改变，大量的出现在转移组织中，这些现象意味着在转移过程中伴随着H3K27ac复发性的改变。

同时也可以发现这些区域大部分都位于启动子之外并且都和其附近基因表达的改变有关，可以推测这些区域代表着增强子元件。使用ChIP-seq测定H3K4me1和ATAC-Seq测染色体可接近性，这两种特征都富集在识别出的GAIN regions中，证明了这些区域是活性增强子元件，这些区域附近的基因也显示与发育显著的关联。

1 FOXA1表达升高与PDA转移和GAIN enhancer激活相关联

为了验证激活GAIN enhancer的TF在PDA的转移中有重要功能，本研究使用了TRAP算法识别了在GAIN enhancer中富集的TF motifs。关注到TF FOXA1,可以发现FOXA1的表达和ChIP-seq分析后的occupancy在转移组织的GAIN regions都是上调的，并且在RNA-FISH的实验中可以发现FOXA1在原始肿瘤和转移组织上都是上调的，这些结果也证实了FOXA1参与到了GAIN enhancer的激活中。从下图的实验（F）可以发现FOXA1的上调发生在PDA的发育过程中。这些结果提示了在PDA发育期间FOXA1上调具有激活胚胎前肠内胚层转录程序的可能性。

1 FOXA1的过表达促进小鼠和人类PDA细胞系GAIN enhancer的激活和转移相关表型

由于在T类器官组织的二维细胞系（KPC-2D）中GAINenhancer存在于部分激活状态，评估了这些元件是否可被FOXA1过度表达完全激活。使用FOXA1 cDNA逆转录病毒转导KPC-2D细胞，当作为2D单层培养时，可以发现FOXA1表达对细胞增殖，克隆生长或细胞迁移没有影响。然而，当在超低粘附板上作为肿瘤球体培养时，FOXA1表达增强了锚固依赖性生长。置于Matrigel-coated Boydenchamber assays中时，FOXA1过表达的KPC-2D细胞也更具侵袭性。当通过尾静脉注射到受体小鼠时，FOXA1还增强了KPC-2D细胞转移到肺组织的能力。在人类PDA细胞系中过表达FOXA1时，观察到增强的肿瘤球形成，其与GAIN区域的H3K27ac的增加和前肠发育基因的转录激活平行。这些结果表明，PDA细胞系中的FOXA1过表达促进GAIN增强子激活和获得转移表型。

1 FOXA1介导的增强子重编程促进有机体移植模型中的PDA发育

考虑到FOXA1上调是否足以在M组织细胞中观察到的整体GAIN增强子激活，在两个独立的T类器官组织（T3和T23）中过表达FOXA1，并进行H3K27ac ChIP-seq。可以观察到，FOXA1表达仅将H3K27ac升高至在匹配的M组织中观察到的水平的约25％。这一结果意味着有其他候选TF与FOXA1合作以促进增强子激活。通过对FOXA1peaks和GAIN区域的TRAP分析识别出相关联的GATA5，BATF2，PRRX2和PAX9 motif。虽然KPC-2D细胞中过量表达GATA5，BATF2，PRRX2或PAX9均导致体外增强的侵袭性，我们专注于GATA5，因为该TF在内胚层发育和PDA发育期间被上调，与FOXA1相似。 GATA5在KPC-2D细胞中的过度表达导致增强的克隆生长和肺定植。 Gata5基因座也获得了M组织中的GAIN增强子。

进一步的研究发现这些研究结果表明，GATA5与FOXA1合作共同激活GAIN增强子并促进体内PDA发育。同时评估FOXA1的必要性，以通过产生具有shRNA介导的敲低或用CRISPR-Cas9基因编辑的敲除。表达shRNA的细胞与GAIN区域的H3K27ac减少有关，FOXA1占有率降低。 FOXA1缺陷型M组织的RNA-seq分析显示GAIN基因和前肠内胚层基因特征的下调。这一结果促使我们在将FOXA1缺乏的M1L组织细胞移植到受体小鼠的胰腺中后，调查PDA的进展。在移植后6周，FOXA1的敲低导致胰腺原发性肿瘤明显较小（10只小鼠的平均肿瘤重量，shRen; 0.91g / shFoxa10.57g，p <0.01）。此外，我们确定10只对照小鼠中有4只转移，而Foxa1敲除与10只小鼠中只有1只（图F）相关。总之，这些发现表明FOXA1-依赖性增强子重编程在体内促进PDA发育和转移。

参考文献：

Roe, J.S., etal., Enhancer Reprogramming PromotesPancreatic Cancer Metastasis. Cell, 2017. 170(5): p. 875-888 e20.

1 PDA类器官的表观基因组分析识别和转移相关的增强活性的反复改变

1 FOXA1表达升高与PDA转移和GAIN enhancer激活相关联

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